根據(jù)各種不同的條件，酶切反應(yīng)的設(shè)計(jì)一般應(yīng)注意以下問題：
1. 加入反應(yīng)的酶體積不超過反應(yīng)總體積的1/10，避免限制酶活性受到甘油的影響。大多數(shù)限制酶貯存在50％甘油溶液中，以避免在-20℃條件下結(jié)冰。當(dāng)zui終反應(yīng)液中甘油濃度大于12％時(shí)，某些限制酶的識(shí)別特異性降低，從而產(chǎn)生星活性，更高濃度的甘油會(huì)抑制酶活性。

2. 多種因素可引發(fā)星型反應(yīng)：①非zui適的pH；②Co2+、Mn2+、2n2+取代Mg2+；③酶濃度大于25u/ug；④鹽濃度降低；⑤高濃度甘油的存在（>12%）；⑥有機(jī)溶劑的存在。

3. 反應(yīng)混合物中DNA底物的濃度不宜太大，小體積中過高濃度的DNA會(huì)形成粘性DNA溶液抑制酶的擴(kuò)散，并降低酶活性。建議酶切反應(yīng)的DNA濃度為0.1-0.4ug/ul。

4. 當(dāng)要用兩種或兩種以上限制酶切割DNA時(shí)，如果這些酶可以在同種緩沖液中作用良好，則兩種酶可同時(shí)切割，如果這些酶所要求的緩沖液有所不同，則可采用以下兩種替代方法：
①先用在低離子強(qiáng)度的緩沖液中活性高的酶切割DNA，然后加入適量NaCl及第二種酶，繼續(xù)反應(yīng)；
②使用能夠使多數(shù)內(nèi)切酶均表現(xiàn)較高活性的單種緩沖液。
5. 用同一種酶切割不同的DNA時(shí)，所需酶量不同，可根據(jù)DNA底物上酶切位點(diǎn)的多少與λDNA存在位點(diǎn)的數(shù)目比較后，決定用酶量。對(duì)于超螺旋DNA，基因組DNA、瓊脂糖包埋的DNA，使用的酶單位活性應(yīng)適當(dāng)加大。
6. 反應(yīng)混合液中加入濃度為0.1mg/ml的BSA，可維持酶的穩(wěn)定性。
7. 酶切底物DNA應(yīng)具備一定的純度，其溶液中不能含有跡量酚、、乙醚，大于10mM的EDTA，去污劑SDS以及過量的鹽離子濃度，否則會(huì)不同程度地影響限制酶的活性。
8.DNA堿基上的甲基化修飾也是影響酶切的一個(gè)重要因素，所以轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)所選擇的受體菌株應(yīng)考慮到使用的菌株中的酶修飾系統(tǒng)。